評估與體會

倪燦榮  張順民

第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院病理科

摘自：2011年03期《診斷病理學(xué)雜志》

常規(guī)病理技術(shù)的脫水石蠟包埋、HE染色的建立已有一百多年的歷史，一直沿用至今。其石蠟切片制作和染色方法中使用的甲醛和二甲苯存在著對職業(yè)工作環(huán)境和排放后對生活環(huán)境的***害和污染，危害人類的生存環(huán)境，為此，全球的病理工作者，在積極努力地尋找甲醛和二甲苯的替代產(chǎn)品，其間有不少改進和替代方法的文獻報道，但應(yīng)用后均不夠理想，未能得到推廣應(yīng)用[1~13]。

本文著重介紹應(yīng)用GS標本套裝試劑制備的石蠟組織切片進行HE染色、免疫組織化學(xué)染色（46種抗體）、免疫熒光組化雙重標記和原位雜交-CISH檢測HER2基因的效果比較。

1. 材料和方法

 1.1 材料

300例人體組織標本包括乳腺癌、前列腺癌、腎癌、子宮肌瘤、宮頸癌、卵巢癌、胃癌、結(jié)腸癌、肺癌和肝癌，以及二例尸檢各臟器等組織均為長海醫(yī)院手術(shù)標本和尸體解剖標本。200例荷瘤大鼠、小鼠、荷瘤裸小鼠；100例***、兔和羊等實驗動物組織的腦、骨、胃、腸、肺、食管、肝、脾、腎、膽、胰、子宮、卵巢、心臟、血管、脊髓、神經(jīng)和皮膚等組織樣本，標準取材并按GS組織固定脫水系列套裝實際說明書操作流程進行后固定、脫水、透明和包埋。

 1.2 試劑

（1）GS組織樣本制備套液及GS病理切片染色套液（內(nèi)含無醛組織固定液，環(huán)保脫水、透明、浸蠟液，HE染色液和脫蠟、透明、封片膠）為哈爾濱格林標本技術(shù)開發(fā)有限公司研制并生產(chǎn)；（2）特異性一抗來源、稀釋度見表1，多聚物酶UIP/HRP購置于日本N-Histofine公司，Code414154F[14]、S-P法主要針對羊來源一抗，購置于美國Sigma公司，羊抗兔LgG-FITC1：200和羊抗鼠LgG-Cy3 1:200購置于美國Sigma公司，Dig標記HPV Kit購置于福州泰普生物科學(xué)有限公司（批號：32090601），Dig標記HBV探討本實驗室制備，CISH-HER2 Kit購置于美國invtrongen公司（批號：84-0150），Tunel kit（Dig標記/HRP-DAB）購置于美國CHEMICON公司（批號：VR1362694）。

 1.3 方法

（1）組織固定、脫水、透明和包埋本文應(yīng)用GS組織固定脫水系列套裝試劑，標準取材后按GS組織固定脫水系列套裝試劑說明書操作流程進行流程進行后固定、脫水、透明和包埋。其流程如下：? 組織固定劑固定60～120min；2 組織脫水劑160～90min；?組織脫水劑||60～90min；? 組織透明劑60～120min；? 浸蠟130～60min；?浸蠟|| 30～60min;? 浸蠟||30～60min，包埋。（2）HE染色石蠟切片用GS無苯脫蠟液脫蠟至水（脫蠟 石蠟切片用脫蠟液|、脫蠟液||、脫蠟液|||各5min，蘇木素染色2min，自來水洗10s，用鹽酸水溶液1:2000分化3s，自流水沖洗2～5min：2 伊紅染色中染1～3min，自來水洗3s，除浮染液3s，瀝干殘余試劑或用電吹風(fēng)吹干，進入除水透明液1-2min，進入透明液2min，***后瀝干封片。（3）免疫組織化學(xué)UIP法與S-P法、免疫熒光組織化學(xué)單染和雙標染色、Tunel法和原位雜交：Dig標記HPV和HBV探針操作流程參閱相關(guān)文獻[14]，CISH-HER2操作流程參閱相關(guān)文獻[15-16]，Tunel法操作流程參考相關(guān)文獻[14，17]。

2.結(jié)果

 2.1 脫水、透明、浸蠟包埋與HE染色

應(yīng)用G S組織固定脫水系列套裝試劑進行固定、脫水、透明、浸蠟和包埋，并按GS染色系列套裝試劑進行HE染色。結(jié)果包埋后的組織塊可以順利的切至3μm的石蠟切片，無苯型脫蠟劑在室溫下2×5min完成石蠟切片脫蠟（免疫組化染色建議3×5脫蠟）。蘇木素染色液和伊紅染色液的染色力強，顏色鮮艷（圖1-2），染色系列試劑中的GS無苯型封片膠透明度及封片效果良好，可以替代以傳統(tǒng)二甲苯為溶劑的封片膠封固切片，減少室內(nèi)的***害氣體污染。

 2.2 免疫組織化學(xué)

利用人結(jié)腸癌、胃癌、腎癌、肺癌、腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌和前列腺癌等組織；動物***、兔、大鼠和小鼠肺、脾、肝、腦和胰腺等組織，分別檢測46種不同抗原（所用一抗來源、稀釋度、種屬特異性詳見表1），免疫組織化學(xué)采用多聚物酶UIP法[14]、S-P法主要針對羊來源一抗[14]、以及免疫熒光雙標記法[14]。IHC檢測結(jié)果顯示，其陽性檢測率和陽性強度均與常規(guī)乙醇脫水、二甲苯透明效果基本一致（圖3-4）。

2.3 原位雜交

應(yīng)用ISH-HBV檢測5例HBV陽性肝癌標本結(jié)果100%陽性（5/5）；ISH-HPV16/18探針檢測5例宮頸癌標本，結(jié)果陽性檢測率為60%（3/5）；，原位雜交CISH法檢測10例乳腺癌HER2原癌基因，結(jié)果陽性檢測率為60%（6/10；低擴增3例，高擴增3例），其陽性檢測率和陽性強度與常規(guī)乙醇脫水、二甲苯透明基本一致（圖5-?????）。

 2.4 Tunel法

檢測10例大鼠實驗?zāi)Ｐ透谓M織分別用GS環(huán)保試劑和常規(guī)脫水透明石蠟切片。均用格林脫蠟液脫蠟至水，Tunel法染色，結(jié)果凋亡指數(shù)檢測率基本一致（圖5-?）。

3.討論

常規(guī)甲醛固定、乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋的石蠟切片和HE染色技術(shù)創(chuàng)立已100多年，是一個良好的組織病理學(xué)技術(shù)方法。但是以今天的眼光來看，傳統(tǒng)石蠟切片制作和染色方法中使用的甲醛和二甲苯存在著對職業(yè)工作環(huán)境和排放后對生活環(huán)境的***害和污染。因此，減少或完全替代甲醛和苯系化學(xué)***害試劑的使用，建立一套替代技術(shù)取代石蠟包埋切片技術(shù)中上述***害試劑的使用是一項意義重大的工作。近十年來，國內(nèi)外相繼推出了數(shù)種甲醛和二甲苯的替代品，這些產(chǎn)品或因功能單一不成系統(tǒng)、或因效能不高達不到技術(shù)要求、或因價格較高不利普及[1-13]。尤其是國內(nèi)很少有廠家研發(fā)和推出類似相對環(huán)保的系列病理試劑。

由哈爾濱格林標本技術(shù)開發(fā)有限公司推出的GS組織固定脫水系列套裝試劑和HE染色系列套裝試劑是國內(nèi)******個專業(yè)廠家推出的******套相對環(huán)保型套裝系列試劑。二年前經(jīng)北京同行的介紹。開始驗證性使用該產(chǎn)品[18-20]，應(yīng)用該公司GS無醛及無二甲苯全程處理液制備30000余例人體各組織標本和100例***、兔和羊等實驗動物組織的各種器官的石蠟包埋切片與常規(guī)石蠟切片驗證性比較試驗，并從HE染色的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察，免疫組織化學(xué)染色（46種抗體）抗原表達狀況、免疫熒光組化雙重標記和原位雜交（HPV、HBV和HER2基因探針）DNA的影響程度等多方面比較。結(jié)果GS無醛及無二甲苯全程處理液制備的石蠟切片軟硬適中，切片厚薄均勻，連續(xù)性好。常規(guī)HE染色細胞形態(tài)完整清晰，蘇木素伊紅染色鮮艷，對比分明。組織脫水到包埋僅需6小時，比常規(guī)12小時大大縮短。常規(guī)HE染色過程中主要的污染源來自二甲苯，GS切片染色技術(shù)不僅杜絕了二甲苯對人體的傷害，而且常規(guī)染色時間45min，GS切片染色時間為13min，染色時間縮短，染色效果符合診斷要求，個別切片因染色時間稍長一點，太鮮艷也會造成視覺上的影響。

為了驗證GS無醛及無二甲苯全程處理液組織包埋切片對IHC和分子雜交DNA檢測的影響程度，我們初步選用100例人體腫瘤標本和50例實驗動物模型，選用多聚物UIP法、S-P法和免疫熒光組織化學(xué)雙重標記方法，分別檢測46種不同******抗體，結(jié)果陽性檢測率和陽性強度與常規(guī)石蠟切片基本一致，說明該GS無醛及無二甲苯全程組織處理液包埋的石蠟切片可用于日常的免疫組化標記和鑒別診斷。ISH也檢測了5例宮頸癌中的HPV，5例肝癌中的HBV和10例乳腺癌中的HER2基因結(jié)果也與常規(guī)石蠟切片基本一致。

經(jīng)上述實際技術(shù)測試結(jié)果顯示：GS系列試劑完全可以替代傳統(tǒng)的以甲醛二甲苯為主體的石蠟切片技術(shù)流程，減少室內(nèi)有***有害氣體的污染和***害作用同時杜絕大量排放此類***害化學(xué)物質(zhì)對生活環(huán)境的污染，期望廣大病理技術(shù)的同道們積極地參與到類似新型環(huán)保試劑的應(yīng)用和技術(shù)實踐中來，為此類新型環(huán)保型試劑技術(shù)性能的提高和不斷完善提供更加充分祥實的技術(shù)信息和使用經(jīng)驗。

圖板說明：

          圖1.使用GS組織固定脫水和HE染色系列套裝試劑行***、兔和大鼠骨關(guān)節(jié)HE染色

圖2.使用GS組織固定脫水和HE染色系列套裝試劑行大鼠肺、皮膚、腫瘤和肝HE染色

圖3.使用GS組織固定脫水、透明系列套裝試劑包埋的動物組織IHC檢測結(jié)果：?小鼠腫瘤模型OCT4；?大鼠肝Foxp3；?大鼠肝F4-80；?大鼠肝Ki67；?大鼠肝TGFβR1；?大鼠腦GFAP；?大鼠腦Nestin；?小鼠肺||1β；?大鼠胰腺AmyIase。

圖4.使用GS的組織固定脫水、透明系列套裝試劑包埋的人體組織IHC檢測結(jié)果：?人結(jié)腸癌Pan-CK；?人肺癌Septin9；?膽囊癌HER2；?人腫瘤Puma；?人乳腺癌HER2；?人乳腺癌ER；?霍奇金細胞CD30；?腺癌細胞Topo|| ａ?膠質(zhì)瘤Ki67-紅/Nestin-綠免疫熒光雙標記。

圖5.使用G S組織固定脫水、透明系列套裝試劑包埋的組織ISH和Tunel檢測結(jié)果：

1?宮頸ISH-HPV；?2乳腺癌CISH-HER2；?3乳腺癌CISH-HER2? 4肝穿ISH-HBV 5?肝癌ISH-HBV? 6大鼠肝Tunel（從左到右）。

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