自制組織芯片測試GS試劑對組織抗原的保存效果

孫廷誼  謝紅建  孔令非

河南省人民醫(yī)院病理科

摘自：2013年第06期《診斷病理學(xué)雜志》

我們自制組織芯片，通過免疫組化染色，對乳腺疾病組織中vimentin的表達(dá)情況進(jìn)行了回顧性檢測，用來測試GS試劑對組織抗原的保存情況，取得較為滿意的效果。

1.材料和方法

 1.1材料

選取河南省人民醫(yī)院病理科2011年7月至12 月資料齊全的乳腺疾病存檔蠟塊80例，其中乳腺纖維瘤20 例，乳腺癌60例；患者術(shù)前未進(jìn)行放療或化療。所選取的蠟 塊當(dāng)時(shí)均是經(jīng)GS無醛固定液固定、GS系列脫水透明套液試 劑制作而成。主要儀器和試劑 Leica染封一體機(jī)，Leica- Band全自動(dòng)免疫組化染色儀，GS系列試劑（哈爾濱格林標(biāo) 本技術(shù)開發(fā)有限公司），vimentin(即用型）和Maxvision試劑 盒均購置于福州邁新生物技術(shù)公司，Leica機(jī)用Bond Polymer Refine Detection 染色試劑盒。

 1.2 方法

  1.2.1 組織芯片制作

用自制的取樣針（內(nèi)徑為1.0 mm) 在蠟塊上均勻地打出直徑稍大于1.0 mm、間距為1.0 mm的小孔，深約2 ~3 mm，制成TMA受體蠟塊。在供體蠟塊上鉆取一小圓柱形組織條，再將其送入受體蠟塊的預(yù)留孔內(nèi)，按—定規(guī)則排列方陣，如此反復(fù)就制成組織芯片蠟塊。將構(gòu)建 好的TMA芯片蠟塊用大載玻片輕輕蓋好，翻轉(zhuǎn)芯片蠟塊放入病理組織漂烘儀的烘片箱內(nèi)，37℃，1 h，使其蠟與新插入的小圓柱狀組織溶為一體，即制成含80個(gè)位點(diǎn)的組織芯片，于4 ℃：冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｇ衅瑫r(shí)組織芯片冷凍15 min以上，切片厚3 μm，65 ℃烤片，HEJHC切片烤15 min。

  1.2.2 傳統(tǒng)HE染色

①切片經(jīng)二甲苯I、II脫蠟各5 min； ②無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇各2 min，自來水洗；③蘇木 精染8 min，自來水洗；④1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒鐘，自來水洗；⑤PBS返藍(lán)1 min，自來水洗；⑥1%水溶性伊紅染1 min； ⑦70%乙醇、95%乙醇各10 s，無水乙醇I、II處理各2 min，二甲苯I、II各2 min，中性樹膠封片。

  1.2.3 GS環(huán)保型染液HE染色

①切片經(jīng)脫蠟液I處理5 min，脫蠟液I處理5 min，自來水洗2 min；②蘇木精染色液 處理3 ~5 min，自來水洗10 s；③分化液2 ~3 s，自來水洗1 min；④藍(lán)化液1 min，自來水洗1 min；⑤伊紅染色液處理1 ~3 min，自來水洗3 s；⑥除浮染液3 s，瀝干殘余試劑；⑦除水透明液處理1 min，瀝干；⑧透明液3 min，無苯封片膠封片。

  1.2.4 IHC手工染色

組織芯片的vimentin IHC染色：切片脫蠟至水；3% H2O2室溫處理10 min；蒸餾水洗，PBS洗2 X 3 min；采用高溫高壓組織抗原修復(fù)方法，枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6. 0)修復(fù)抗原2 min；蒸溜水洗，PBS洗2 X 3 min，滴加一抗工作液，室溫1 h；PBS洗2 X3 min；滴加Maxvision二抗，室溫15 min；PBS 洗 2 X3 min；PBS 洗 3 X3 min；DAB 顯色；蘇木精 復(fù)染；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。選用已知陽性的切片作陽性對照，以PBS替代******抗體作陰性對照。

  1.2.5 全自動(dòng)IHC染色

嚴(yán)格按Leica-Band全自動(dòng)免疫組化染色儀SOP文件操作。

2.結(jié)果

 2.1 組織芯片的HE染色

自制的組織芯片各點(diǎn)陣排列整齊，薄厚均勻，無移位、脫失現(xiàn)象。HE染色效果良好，細(xì)胞形態(tài)完整，組織結(jié)構(gòu)顯示清晰，色彩鮮艷，核質(zhì)對比分明，染色結(jié)果相比二者無明顯差異。

 2.2 組織芯片的IHC染色

自制的組織芯片經(jīng)手工和 Leica Bond Max兩種免疫組化染色后各點(diǎn)陣排列整齊、薄厚均勻，無移位、脫失現(xiàn)象。vimentin胞質(zhì)著色，定位準(zhǔn)確，背景清晰，兩種免疫組化結(jié)果未見明顯差異。

3.討論

vimentin在免疫組化染色中作為對照的目的是觀察組織經(jīng)甲醛固定后預(yù)期抗原表達(dá)的敏感性，按固定后抗原損傷的程度來進(jìn)行分析。vimentin幾乎在任何組織中都陽性，在與上皮組織相連接的間質(zhì)中存在著大量的血管vimentin陽性，如果在同一張切片的間質(zhì)中出現(xiàn)vimentin染色微弱或部分區(qū)域變?nèi)醯那闆r，表明是處理的不當(dāng)導(dǎo)致抗原破壞，所以在IHC實(shí)驗(yàn)中常加入vimentin染色，用于指導(dǎo)觀察組織固定后抗原表達(dá)敏感性情況。本實(shí)驗(yàn)vimentin胞質(zhì)著色，定位準(zhǔn)確、背景清晰，免疫組化染色結(jié)果可靠，證明標(biāo)本組織的細(xì)胞抗原性保存良好。

GS試劑不含甲醛、二甲苯等有毒有害物質(zhì)，運(yùn)用界面化學(xué)及電荷占位原理，對組織標(biāo)本進(jìn)行脫水、透明和浸蠟。GS 試劑有較強(qiáng)的固定、脫水、脫脂兼硬化作用，不易導(dǎo)致組織過度收縮，無細(xì)胞空泡與核固縮現(xiàn)象產(chǎn)生，處理的組織軟硬適中，尤其對脂肪、淋巴組織等組織的處理效果較好，處理較堅(jiān)韌的子宮肌瘤、皮膚組織也能使其具有較好的柔韌度而有利 于切片。GS試劑對組織滲透性強(qiáng)，能縮短脫水時(shí)間，能保持 良好的組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，同時(shí)能保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，能******限度地保護(hù)組織中的抗原和核酸不被破壞、降解或擴(kuò)散，對DNA和RNA保存較佳，也有利于顯示細(xì)胞的亞結(jié)構(gòu)。 通過實(shí)驗(yàn)，我們體會(huì)到用GS無醛固定液固定、GS系列脫水透明套液試劑制作的組織蠟塊，經(jīng)過較長時(shí)間放置后切片所做的手工和全自動(dòng)染色的HE及IHC染色均能取得滿意的 結(jié)果。