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病理論壇在線咨詢GS環保型病理試劑的應用及中期實驗評價
課題組織：中華醫學會病理學分會病理技術學組
參與單位：
北京協和醫院
醫科院腫瘤醫院
北京軍區總醫院
解放軍總醫院
北京大學腫瘤醫院
第二軍醫大學長海醫院
第二軍醫大學長征醫院
浙江大學******附院
第四軍醫大學西京醫院
南方醫科大學病理學系
鄭州大學******醫院
北京大學人民醫院病理中心實驗室
GS環保型病理試劑的應用及中期實驗評價
摘自：《2011全國西安病理技術學術會議暨全年
第七屆病理技術學術會議論文集》
病理組織制片、染色、免疫組織化學染色、組織原位雜交及核酸提取過程中，甲醛和二甲苯作為病理常規試劑被大量應用。這些試劑是公認的化學有毒有害高污染化學試劑，具有強烈的刺激性和揮發性，不僅污染實驗室工作環境，而且嚴重危害身體健康。甲醛和二甲苯等有毒有害化學試劑的回收及無害化處理需要花費高昂的費用，而不經無害化處理直接將其排放會造成城市水系和空氣的污染。隨著人們對健康環保工作和生活環境的不斷關注，醫務人員非常渴望建立一個環保型實驗室，以減少化學藥品對人類的危害。因此，尋找一種對人體******無害且環保的甲醛和二甲苯理想替代品，已成為國內外病理技術工作者的一種迫切愿望。
GS環保型病理系列試劑的短期實驗表明在病理組織學形態、免疫組織化學、核酸提取和FISH方面完全能夠達到臨床病理診斷的全部要求。為了考察GS系列試劑的中期技術性能，從2011年3月起我們組織了GS系列試劑的中期實驗。
實驗評價結論：形態學、免疫組織化學、核酸提取、熒光實時定量PCR和組織原位熒光分子雜交實驗的結果表明，格林標本GS系列產品完全可以滿足病理技術的要求，在病理實驗室徹底替代毒害污染嚴重的甲醛、二甲苯和汞，實現病理實驗室的無害化。 SHAPE \* MERGEFORMAT SHAPE \* MERGEFORMAT
《GS無醛固定液及無醛無苯組織脫水系列試劑與甲醛二甲苯傳統試劑短中期固定脫水效果比較評價》
一、實驗設計
1. 課題目的
通過GS試劑與傳統試劑的比較試驗，驗證GS試劑在60天時間段對組織形態、抗原性、RNA/DNA的保存能力。
2. 參與課題單位及實驗標本選擇
北京協和醫院、醫科院腫瘤醫院、北京軍區總醫院、解放軍總醫院、北京大學腫瘤醫院、第二軍醫大學長海醫院、第二軍醫大學長征醫院、浙江大學******附院、第四軍醫大學西京醫院、南方醫科大學病理學系醫院、鄭州大學******醫院。每家醫院選擇乳腺癌、結腸癌、肺癌、卵巢癌、淋巴瘤、五種組織各兩例，總計110例標本。
3. 課題設計及比較評價內容
10%中性甲醛：固定1天、 3天、 7天、15天、30天、60天 共取材6塊
無醛型固定液：固定1天、 3天、 7天、15天、30天、60天 共取材6塊
為統一實驗標準，要求取得一個足夠大的標本后（要求未經固定的新鮮標本），分成12塊不小于3mm×3mm的實質性腫瘤組織，分別裝入10%中性甲醛和無醛型固定液中固定，分別于固定后1天（指24小時）、 3天、 7天、15天、30天、60天取出一塊組織脫水包埋。待全部標本制備完成后，統一切片并同時進行組化染色實驗。
實驗內容：
乳腺癌-ER PR C-erb-B2 her-2基因熒光原位分子雜交
結腸癌- CA-19-9 p53
肺癌 - EGFR ki67
卵巢癌- CA-125
淋巴瘤- LCA CD20 CD45RO
以上腫瘤的核酸提取和相關腫瘤基因的熒光實時定量熒光PCR。
關于her-2基因熒光原位分子雜交檢測的說明：
her-2基因熒光原位分子雜交可以先做C-erb-B2染色，選擇2例中一例C-erb-B2++至+++陽性的標本做FISH即可。具體做法可以首先選擇固定1天及60天的兩個時間點，如60天時間點FISH檢測陽性，則其他時間點可以不做。如60天時間點為FISH陰性，則應繼續做固定30天時間點，依次類推直至做到FISH陽性的時間點。
關于組織脫水的說明：
10%甲醛固定的實驗組織，使用傳統脫水方法脫水透明；
無醛固定液固定的實驗組織，使用GS系列脫水透明
擬于2011年4月各課題單位開始于6月底基本完成實驗評估。請保留實驗標本蠟塊，染色切片以及實驗記錄數據資料。在完成實驗后統一提交北大人民醫院病理中心實驗室，以便統計分析。
二、關于環保型無醛組織固定液
1. 歷史回顧
采用甲醛固定組織的方法已延續了一百多年，甲醛對組織滲透能力強，組織固定均勻，組織收縮小，盡管它具有高毒性，但由于其成本低，能較好地保存組織結構，因此至今仍廣泛被人們接受。甲醛主要存在以下缺點：
（1）易揮發，具有較強烈的刺激性，嚴重刺激呼吸道黏膜和眼結膜，強烈的刺激可引起呼吸困難和眼睛流淚。攝入和吸入易導致中毒。嚴重造成空氣和環境污染，而防護又極為困難。國內外醫學研究證實，人體皮膚直接接觸甲醛時，會引發過敏反應、皮炎或濕疹。長期接觸甲醛可能會引發慢性呼吸道疾病和腫瘤發生，如鼻咽癌、結腸癌、腦瘤、白血病，引起體內白細胞數量下降，導致記憶力和智力下降。2004年6月15日WHO正式宣布甲醛為致癌物質，同時提醒人們要重視甲醛的致癌性，并采取預防措施。
（2）甲醛存放過久易聚合成三聚甲醛，而影響組織標本固定效果。
（3）固定時間較長的組織內易形成甲醛色素，與含鐵血黃素相混淆，易導致組織酸化影響染色效果，使診斷受到嚴重影響。
（4）不能固定肝糖原和尿酸。
（5）廢液需特殊處理，應由持證廢物運輸或******企業來處置，盡可能蒸餾回收，不能直接排入下水道。廢液處理費較高，每千克30-50元。在室溫下，用甲醛固定的組織很難保存高分子量DNA，造成DNA、RNA抽提困難，生物學分析成功率難以確定。抽提的DNA分子的大小又與固定的溫度直接相關。即使短暫的甲醛固定切片，其DNA的溶解度也會明顯降低（也會明顯降低DNA的可溶性）。在固定過程中，約有30%的核酸丟失。多項研究顯示，無交聯作用的醇類固定劑在保存DNA方面比醛類固定劑效果更好。但單純用乙醇類固定液，易導致核固縮、細胞空泡出現，組織皺縮，組織變硬變脆等缺陷。理想的固定液應該是：毒性低，能有效地保存組織細胞的形態結構、高度的保存組織細胞的免疫原性和DNA/RNA分子結構，以便進行免疫細胞/組織化學和分子生物學研究。
近年來，隨著對實驗室環境安全更高的要求以及分子生物學飛速發展的需求，研發和生產理想的******低毒的甲醛替代固定劑已成大勢所趨刻不容緩。目前國內外相繼研制并生產了環保型無醛固定劑，令人滿意的替代品具有極大的技術優勢。如英國的FineFIX、美國的HISTOCHOICE 和國內的GS新型生物組織標本固定劑等。環保型無醛固定液是組織固定技術的革命性突破，使建立綠色病理實驗室的理想成為現實。無醛固定劑的主要特點是：
（1）無色、無刺激性，低揮發性，不含甲醛等任何醛類化合物，綠色環保，易生物降解，使用后不會對環境產生危害。對組織滲透性強。
（2）能保持良好的組織形態學結構，同時能保護細胞膜的完整性。
（3）有較強的固定、脫水、脫脂兼硬化作用，不易導致組織過度收縮，無細胞空泡與核固縮現象。
（4）能******限度地保護組織中的抗原和核酸不被破壞、降解或彌散。免疫組化檢測結果顯示：在相同染色條件下陽性率和陽性強度與傳統制片法效果基本一致。無醛固定液固定的組織，蛋白質氨基酸分子之間不發生交聯，對組織內抗原不構成交聯型遮蓋，某些免疫組化檢測無需抗原修復處理，簡化了免疫組化染色程序，******了修復可能產生的假陽性，提高了抗原對抗體的敏感性。
（5）對DNA、RNA保存較佳，有利于對組織標本的分子生物學研究。以乙醇成分為主的無醛固定劑，回收簡便易行，不需甲醛中和劑進行處理廢液，可依據乙醇廢液處理管理條例處置廢液。經大量實際應用，無醛固定液與傳統甲醛固定液處理的組織制片效果基本相同，完全可以取代甲醛對組織標本進行固定。
2. 國外環保型試劑的狀況
（1）FineFIX 是一種濃縮無醛固定劑，使用時以三倍的95%乙醇稀釋成工作液，被認為是理想的甲醛替代品，可以獲得良好的組織細胞結構、免疫原性和良好的核酸保存效果。在手術標本的固定方面穿透速度較快，國外一些實驗室對其固定效果進行了HE染色形態學分析、免疫組織化學染色實驗、RNA/DNA提取對比實驗和PCR基因擴增實驗結果滿意，被認為在組織固定技方術方面具有里程碑式的進步意義。目前國內已有一些醫院使用FineFIX進行標本固定效果良好。
（2）TISSUE FIXATIVE-HISTOCHOICE 是美國Amresco公司生產的無醛環保型組織固定劑。目前在歐美和亞太一些國家的應用試驗證實了良好的效果。
TISSUE FIXATIVE-HISTOCHOICE 可用于常規組織學、免疫組織化學、分子雜交、細胞學等方面的組織固定。美國耶魯大學的一個試驗小組對其性能進行了較為******的分析。
Table 1 將HISTOCHOICE 和NBF（中******爾馬林）在涉及上皮、淋巴、神經、血管和腫瘤標志等 21種常用免疫組織化學染色的結果進行了對比分析結果表明：57% 采用 HISTOCHOICE 固定的標本染色結果具有較NBF更高的染色強度，28.6%的標本染色結果兩種固定劑染色強度相同，14.3% 的標本染色結果NBF具有更高的強度。
Table 2 對兩種固定液固定標本染色的色值對比分析則表明：HISTOCHOICE 固定的標本80%的染色色值優于NBF。
3. GS無醛固定液：是國內企業自行研制生產的環保型固定液，該無醛固定液目前已被數十家大型醫院使用。實驗證明GS無醛固定液能夠良好的保存組織細胞的形態結構，與甲醛相比具有更良好的鏡下形態結構。
使用GS無醛組織標本固定液固定GS系列脫水透明染色試劑制備的兔腎曲管切片 HE 染色
本次涉及全國十余家醫院和大學科研機構的綜合實驗表明，GS無醛固定液固定的外檢標本，在病理形態學方面能夠保持良好的組織細胞形態、在大多數免疫組化染色中都能優于或等于甲醛固定的同一組標本。此外，GS無醛固定液固定的外檢標本在核酸提取和實時定量熒光PCR對比實驗中也獲得了滿意的結果。
1 2 3 4 5 6 7 8 9
電泳圖中上半部為甲醛固定標本下半部為GS無醛固定液固定的標本1-9分別為1，結腸癌、2，卵巢粘液腺癌，3，移行細胞癌，4，肝癌、5，胰腺癌、6，鱗狀細胞癌、7乳腺癌、8，子宮內膜癌、9，卵巢非粘液癌。
（圖1）用10%中性甲醛固定1天的乳腺癌，結腸癌，肺癌，卵巢癌，淋巴瘤的線性圖譜其基線期、指數增長期、線性增長期和平臺期理論擴增成立。擴增圖譜從左到右分別為乳腺癌，結腸癌，肺癌，卵巢癌，淋巴瘤。說明10%中性甲醛固定1天能較好的保存了模板基因。
（圖2）GS組織固定脫水系列套裝試劑固定1天的乳腺癌，結腸癌，肺癌，卵巢癌，淋巴瘤的線性圖譜其基線期、指數增長期、線性增長期和平臺期理論擴增成立。擴增圖譜從左到右分別為乳腺癌，結腸癌，肺癌，卵巢癌，淋巴瘤。說明GS組織固定脫水系列套裝試劑固定1天和10%中性甲醛固定1天的標本大致相同，也能較好的保存模板基因。
（圖3）用10%中性甲醛固定60天的乳腺癌，結腸癌，肺癌，卵巢癌，淋巴瘤的線性圖譜其基線期，指數增長期，線性增長期和平臺期理論擴增成立。擴增圖譜從左到右分別為乳腺癌，結腸癌，肺癌，卵巢癌，淋巴瘤。說明10%中性甲醛固定60天后仍能較好的保存了模板基因。
(圖4) GS組織固定脫水系列套裝試劑固定60天的乳腺癌，結腸癌，肺癌，卵巢癌，淋巴瘤的線性圖譜其基線期，指數增長期，線性增長期和平臺期理論擴增成立。擴增圖譜從左到右分別為乳腺癌，結腸癌，肺癌，卵巢癌，淋巴瘤。說明GS組織固定脫水系列套裝試劑固定60天和10%中性甲醛固定60天的標本大致相同，也能較好的保存模板基因。
實驗證明，只要按照病理標本固定取材規范的要求對病理標本進行規范化的固定和取材，完全采用GS無醛固定液和無笨脫水試劑制備的組織標本可以良好的完成各項病理實驗。此外本實驗說明，使用GS系列環保試劑處理的標本具有良好的形態結構和基因分子結構保存性能。
三、環保型組織脫水透明染色系列試劑
1. 環保型組織透明劑的國內外概況
傳統組織處理和染色過程中，目前被病理實驗室大量使用的二甲苯是一種對人體具有較強毒害作用的有機化學試劑。它極易揮發，短期內吸入高濃度二甲苯可出現上呼吸道明顯的刺激癥狀、眼結膜及咽部充血、頭暈、惡心、嘔吐、胸悶、四肢無力、意識模糊、步態蹣跚，重者可有躁動，抽搐或昏迷，有的可能出現癔病樣發作。長期使用會導致骨髓抑制，引起白細胞數量降低，有可能出現神經衰弱綜合征，女性出現月經異常，常出現皮膚干燥、皸裂、皮炎等。除對病理工作者的健康構成威脅外，有的單位還將廢棄的二甲苯大量的傾倒進下水道也造成了更大范圍的城市水系環境污染。普通的手套材料不能提供充分的保護。在組織處理過程中，若在二甲苯中浸泡時間過長，易產生組織收縮和硬化現象，影響制片質量。
為了克服二甲苯存在的各種缺點，國內外病理工作者都在試圖尋找一種較為理想的二甲苯代用品，既環保又能有效代替二甲苯的作用來滿足病理工作的需要。值得注意的是近幾年來國內外市場上出現了一些環保型脫蠟劑、透明劑和封片劑，如美國Amresco公司生產的CLEARING AGENT、國產GS組織透明液、WaxOut、TO透明劑等。
除GS組織透明液外，絕大部分的此類試劑只偶見零星的使用經驗，而未見系統的大范圍、大樣本量的系統實驗報道。這些試劑均為非苯類******型復合試劑，可以替代二甲苯對組織切片進行脫蠟和染色脫水后的透明處理以及封片，徹底根除了二甲苯對人體的傷害及其對環境的污染。環保型脫蠟劑，使組織切片脫蠟徹底，速度快。環保型透明劑對組織滲透力強，處理組織軟硬適中，對組織處理柔和，組織標本即使較長時間浸泡在其中也不會出現明顯的收縮和硬化現象，不易使組織變硬變脆，特別是對子宮肌瘤、皮膚等較韌的含纖維較多的組織柔韌度較好，切片質量好于傳統制片法。
總之，針對甲醛的高毒性、致癌性，國內外學者進行了多年研究，如在甲醛溶液中加入添加劑以減少甲醛的揮發，但效果仍不理想，即使加強通風，并不能完全******其危害。使用環保試劑替代甲醛及苯類試劑后，從源頭上杜絕了有害試劑對室內外環境的污染。環保型試劑的問世，為建立“綠色實驗室”奠定了良好基礎，未來的病理實驗室將逐步成為環保型的實驗室。經大量實際應用證實，環保型試劑，完全適用于病理診斷所需的常規ＨＥ染色、免疫組化染色、組織化學染色及熒光原位雜交檢測等，其各種染色效果與傳統方法制作的切片染色效果相同，可廣泛應用于病理技術工作中。
美國Amresco公司生產的CLEARING AGENT、國產WaxOut、TO透明劑均為單一的組織脫蠟透明劑，經試用證明可以替代二甲苯完成組織制片。WaxOut在北京的近十家醫院已有近10年的使用文獻資料。
格林標本研制的GS系列組織脫水透明劑為系列試劑套裝，從2009年至今已有北京、上海、山東、河北、河南、廣西、湖南、陜西、江蘇、廣東等省市的數十家大中型醫院病理科和實驗室進行試用并投入使用。目前，該系列環保型試劑包括：無醛標本固定劑、無苯脫水套裝、無苯脫水機清洗劑、無苯無汞染色套裝和無苯封片膠、浸蠟及包埋切片石蠟。形成了完整的環保型病理專用試劑系列。
GS組織后固定脫水透明浸蠟和脫水機清洗液套裝試劑
格林標本GS系列環保型病理組織標本制備系列試劑，是一套具有開創性的組織病理學標本制備試劑，實現了從標本固定到完成各種染色直至切片封固全過程的無醛、無苯、無汞、環保化。
使用GS組織脫水套裝試
劑的脫水程序及試劑更換方法
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儲液槽 |
試劑名稱 |
工作時間 |
合計時間 |
備 注 |
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1號 |
固定液 |
2小時 |
4小時 |
注：在常溫、常壓下進行組織處理。每次換液1.3.5.7.9液體倒掉；2.4.6.8.10液體前移。換液標準為，一般在處理標本4500塊左右。 |
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2號 |
固定液 |
2小時 |
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3號 |
80%乙醇 |
30分鐘 |
1小時 |
|
|
4號 |
80%乙醇 |
30分鐘 |
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5號 |
脫水液I |
40分鐘 |
1小時40分 |
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6號 |
脫水液I |
1小時 |
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7號 |
脫水液II |
50分鐘 |
1小時50分 |
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|
8號 |
脫水液II |
1小時 |
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|
9號 |
透明液 |
1小時 |
2.5小時 |
|
|
10號 |
透明液 |
1.5小時 |
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蠟缸1 |
浸蠟液I |
2小時 |
第1號浸蠟液每周須換一次，2.3.4號前移，3號或4號更新。 |
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蠟缸2 |
浸蠟液I |
1小時 |
||
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蠟缸3 |
浸蠟液II |
30分鐘 |
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|
蠟缸4 |
浸蠟液II |
5分鐘 |
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|
11號 |
工作槽清洗液I |
自動標準清洗程序 |
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12號 |
工作槽清洗液II |
自動標準清洗程序 |
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|
13號 |
無水乙醇 |
自動標準清洗程序 |
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四、GS系列試劑聯合應用的評價
在嚴格篩選基礎上，對具有詳細記錄的實驗材料和數據納入對比分析評價
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標本在甲醛傳統試劑中的實驗過程 |
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標本 |
標本編號 |
標本病理號 |
標本取材時間 |
標本固定時間 |
標本前期固定時長 |
標本處理 時長 |
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乳癌 |
R-A1(1) |
B0236094 |
3月2日 2:45pm |
3月2日 2:50pm |
24h |
14h6min |
|
|
|
R-A1(3) |
B0236094 |
3月2日 2:45pm |
3月2日 2:50pm |
72h |
14h6min |
|
|
|
R-A1(7) |
B0236094 |
3月2日 2:45pm |
3月2日 2:50pm |
168h |
14h6min |
|
|
|
R-A1(15) |
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