GS環保試劑在病理制片技術工作中的應用

GS環保試劑在病理制片技術工作中的應用

      田玉旺 朱紅艷 李琳 苗金紅 朱培雙 邢宜

      北京軍區總醫院病理科

在日常病理組織制片及染色過程中，甲醛和二甲苯作為病理常規試劑被大量應用。這些試劑具有強烈的刺激性和揮發性，不僅污染環境，而且嚴重危害身體健康。因此，尋找一種對人體******無害且安全的甲醛和二甲苯替代品，已成為病理技術工作者的一種迫切愿望。本文將環保型“GS組織樣本制備及染色套液”應用于病理技術工作中，收到了理想制片效果。

 1. 材料與方法

  1.1 標本　

臨床送檢的各種活體組織病理標本。一組采用傳統石蠟制片方法；另組采用環保試劑制片方法，比較二者制片后的各種染色效果。如：HE染色、免疫組化染色及組織化學染色。

  1.2 GS環保試劑 

GS組織樣本制備套液及GS病理切片染色套液(由哈爾濱格林標本技術開發有限公司研制并生產)。

  1.3方法

   1.3.1 傳統石蠟制片法  組織經常規10%中******爾馬林固定，酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，厚4-5微米。

   1.3.2 GS環保試劑制片方法  離體新鮮組織標本經下列步驟處理 = 1 \* GB3 ①固定液 = 1 \* ROMAN I 1h、固定液 = 2 \* ROMAN II 3h； = 2 \* GB3 ②脫水液 = 1 \* ROMAN I×2，分別為40min、1h，脫水液 = 2 \* ROMAN II ×2，分別為30min、1h； = 3 \* GB3 ③透明液 = 1 \* ROMAN I 1h，透明液 = 2 \* ROMAN II 1h30min； = 4 \* GB3 ④浸蠟液 = 1 \* ROMAN I、 = 2 \* ROMAN II各1h30min，石蠟包埋，切片，厚4-5微米。

   1.3.3 傳統HE染色方法   = 1 \* GB3 ①切片經二甲苯 = 1 \* ROMAN I、 = 2 \* ROMAN II脫蠟各5min； = 2 \* GB3 ②無水酒精、95%酒精、80%酒精各2min，自來水洗； = 3 \* GB3 ③蘇木素染8min，自來水洗； = 4 \* GB3 ④1%鹽酸酒精分化數秒鐘，自來水洗； = 5 \* GB3 ⑤1%氨水返藍1min，自來水洗； = 6 \* GB3 ⑥1%水溶性伊紅染1min； = 7 \* GB3 ⑦70%酒精、95%酒精各10s，無水酒精 = 1 \* ROMAN I、 = 2 \* ROMAN II各2min，二甲苯 = 1 \* ROMAN I、 = 2 \* ROMAN II各2min，中性樹膠封片。

   1.3.4 GS環保型染液HE染色步驟   = 1 \* GB3 ①切片經脫蠟液 = 1 \* ROMAN I 5min，脫蠟液 = 2 \* ROMAN II ５min，自來水洗2min； = 2 \* GB3 ②蘇木素染色液3～5min，自來水洗10s； = 3 \* GB3 ③分化液2～3s，自來水洗1min； = 4 \* GB3 ④藍化液1min，自來水洗1min； = 5 \* GB3 ⑤伊紅染色液1～3min，自來水洗3s； = 6 \* GB3 ⑥除浮染液3s，瀝干殘余試劑； = 7 \* GB3 ⑦除水透明液1min，瀝干； = 8 \* GB3 ⑧透明液3min，無苯封片膠封片。

   1.3.5 免疫組織化學染色  乳腺組織采用PV-6000通用二步法分別進行P63和34βE12染色，具體染色步驟同常規。

   1.3.6 組織化學染色  胃黏膜組織進行PAS染色，腎組織進行PAMS染色，具體染色步驟同常規。

 2. 結果

2.1 采用GS組織樣本制備套液制作的組織蠟塊，在切片中感覺組織塊軟硬適中，切片厚薄均勻，連續性好，與傳統方法制備的組織蠟塊切片效果基本相同。脂肪組織、子宮肌瘤及皮膚等組織切片效果優于傳統方法。采用環保型GS染色套液進行HE染色，染液滲透力強，染色速度快，組織結構顯示清晰，色彩鮮艷，核漿對比分明，與傳統HE染色結果相比二者無明顯差異（圖1）。

2.2 采用環保型GS組織樣本制備套液制作的乳腺組織石蠟切片，經免疫組化P63和34βE12染色，結果顯示，細胞內抗原成分保存良好，陽性結果定位準確，背景清晰，與傳統方法制片染色效果基本相同（圖2，3）。

2.3 GS組織樣本制備套液制作的石蠟切片，腎組織進行PAMS染色，胃粘膜組織行PAS組織化學染色，結果顯示，腎小球基底膜和胃組織中的中性粘液染色清晰，色澤鮮艷，陽性物質定位準確，與傳統方法制片染色效果相同（圖4,5）。

 3. 討論

3.1 在組織處理過程中，組織固定至關重要，它直接影響著各種染色效果。采用甲醛固定組織的模式已延續了一百多年。它對組織滲透能力強，組織固定均勻，組織收縮小，盡管它具有高毒性，但由于其成本低，能較好地保存組織結構，所以至今仍廣泛被人們所接受。甲醛主要存在以下缺點：①易揮發，具有較強烈的刺激性和腐蝕性^[1]，嚴重造成空氣和環境污染，而防護又極為困難。國內外醫學研究證實，人體皮膚直接接觸甲醛時，會引發過敏反應、皮炎或濕疹。長期接觸甲醛可能會引發慢性呼吸道疾病、癌癥發生，如鼻咽癌、結腸癌、腦瘤、白血病，引起體內白細胞數量下降，導致記憶力和智力下降。2004年6月15日WHO正式宣布甲醛為致癌物質，同時提醒人們要重視甲醛的致癌性，并采取預防措施。②甲醛存放過久易產生白色沉淀即三聚甲醛，而影響組織標本固定效果；③甲醛容易氧化變成甲酸，使溶液變為酸性，導致標本酸化，嚴重時影響細胞核的染色效果；使用甲醛固定的陳舊組織，以多血的臟器如脾和肝等，組織內易形成甲醛色素，易與含鐵血黃素相混淆，使病理診斷受到嚴重影響；④不能固定肝糖原和尿酸；⑤廢液需特殊處理，不能直接排入管道。廢液處理費較高，每千克30～40元。 = 6 \* GB3 ⑥目前采用的以醛類為基礎的固定液（如甲醛）處理標本，可引起組織內廣泛的蛋白質交聯，組織切片進行免疫組化染色時因蛋白質交聯需進行抗原修復。研究顯示，無交聯作用的醇類固定劑在保存DNA方面比醛類固定劑效果更好。若單純用純酒精固定液或乙醇類固定液，易導致核固縮、細胞空泡出現，組織皺縮，組織變硬變脆等缺陷。理想固定液應該是：毒性低，HE、免疫組織化學及組織化學等染色均可達到******效果，同時還有利于DNA/RNA生物大分子的修復，以便進行分子生物學研究。

3.2 近年來，隨著對實驗室環境安全更高的要求以及分子生物學飛速發展的需求，研發和生產理想的沒有毒性的甲醛替代固定劑已成大勢所趨刻不容緩。雖然國外已有使用甲醛、苯類等綠色替代產品進行病理制片的相關報道^[2-4]，但國內相關報道較少。本文采用的國產GS固定液為環保型無醛復合固定液，它是固定技術的新突破，是病理工作者的福音，它將使建立綠色病理實驗室夢想成真。它的特點是無色、無刺激性，低揮發性，不含甲醛等任何醛類化合物，綠色環保，易生物降解，使用后不會對環境產生危害。經大量實際應用，GS固定液與傳統甲醛固定液處理的組織制片效果基本相同，它完全可以取代甲醛對組織標本進行固定。它的主要特點 = 1 \* GB3 ①對組織滲透性強，能縮短脫水時間。 = 2 \* GB3 ②能保持良好的組織形態學結構，同時能保護細胞膜的完整性。 = 3 \* GB3 ③有較強的固定、脫水、脫脂兼硬化作用，不易導致組織過度收縮，無細胞空泡與核固縮現象產生。 = 4 \* GB3 ④經GS固定液保存的大體標本，取材時觸之感覺良好，易于分離并切取較薄的具有代表性的組織塊。可去除脂肪組織標本的粘滑感及粘稠性，使清潔工作快速及簡單。尤其對脂肪含量較豐富的組織處理效果更佳。 = 5 \* GB3 ⑤能******限度地保護組織中的抗原和核酸不被破壞、降解或擴散。免疫組化檢測結果顯示：陽性率和陽性強度與傳統制片法效果一致。 = 6 \* GB3 ⑥對DNA和RNA保存較佳，有利于顯示細胞的亞結構，對組織標本的分子生物學研究較好，根除了在分子生物學研究中必須使用新鮮組織的必要性。 = 7 \* GB3 ⑦GS固定液回收簡便易行，不需甲醛中和劑進行處理廢液，可依據乙醇廢液處理管理條例處置廢液。

3.3 GS脫水液的脫水效果好，不會產生組織脫水過度或脫水不夠現象，不易造成組織過度硬化，大小組織可同時進行處理，處理的組織軟硬適中，尤其對脂肪、淋巴組織及較堅韌的子宮肌瘤等組織的處理較傳統方法制片效果好。

3.4 傳統組織處理和染色過程中，二甲苯被病理實驗室大量使用，它極易揮發，是一種對人體具有較強毒害作用的有機化學試劑。其毒性主要是對************和植物神經的麻醉及粘膜的刺激作用，長期使用會導致頭暈、******、肢體震顫、*********下降等，是致癌物質之一^[5]。除對病理工作者的健康構成威脅外，有的單位還將廢棄的二甲苯大量的傾倒進下水道也造成了更大范圍的城市水系環境污染。在組織處理過程中，若在二甲苯中浸泡時間過長，易產生組織收縮和硬化現象，常使含纖維豐富的組織如子宮肌瘤等組織變得堅硬難切，使含膠質較多的組織變脆后切成條狀，使含脂肪較多的組織脫脂不凈影響組織浸蠟，導致制片質量下降。

3.5 為了克服二甲苯存在的缺點，有的學者嘗試用脫色汽油^[6]、硬脂酸^[7,8]、異丙醇^[9]、松節油等替代二甲苯，雖取得一定效果，但還是存在許多弊端。我們在組織處理和染色中采用了GS環保型脫蠟劑、透明劑和封片劑，收到了理想制片效果。這些試劑均為非苯類******型復合試劑，可以替代二甲苯對組織切片進行脫蠟和染色脫水后的透明處理以及封片，徹底根除了二甲苯對人體的傷害及其對環境的污染。GS脫蠟劑，使組織切片脫蠟徹底，速度快。GS透明劑對組織滲透力強，處理組織軟硬適中，對組織處理較溫和，組織標本即使較長時間浸泡在其中也不會出現明顯的收縮和硬化現象，不易使組織變硬變脆，特別是對子宮肌瘤、皮膚等較韌的含纖維較多的組織柔韌度較好，切片質量好于傳統制片法。

3.6 HE染色過程中使用的GS蘇木素染色液為無汞染液，對人無危害，對組織親和力強，染色速度快，不易產生氧化膜而污染組織，切片長期存放細胞核不易褪色，染液使用時間長。鏡下組織切片色彩鮮艷，細胞結構清晰，核漿對比分明，與傳統HE染色效果一致。

3.7 取材后的組織樣本體積在1.5cm×1.5cm×0.3cm范圍較好。手術大標本，建議切開后固定，固定劑的量應為標本體積的4～5倍。

針對甲醛和二甲苯的高毒性，國內外學者進行了多年研究，如在甲醛溶液中加入添加劑以減少甲醛的揮發，但效果仍不理想，即使加強通風，并不能完全******其危害。我們使用GS環保試劑替代甲醛及苯類試劑后，從源頭上杜絕了有害試劑對室內外環境的污染。GS環保試劑的問世，為建立“綠色實驗室”奠定了良好基礎，未來的病理實驗室將逐步成為環保型的實驗室。經大量實際應用證實，環保型GS組織樣本制備套液和染色液，完全適用于病理診斷所需的常規HE染色、免疫組化染色及組織化學染色等，其各種染色效果與傳統方法制作的切片染色效果相同，值得同行廣泛應用。

參考文獻

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圖3乳腺腺病：腺上皮細胞胞漿34βE12(+)。PV-6000法×200  

圖4 腎組織：腎小球基底膜呈黑色。PAMS×400

圖5 胃黏膜組織：中性黏液呈紅色。PAS×400

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