GS環保試劑在骨髓病理石蠟包埋制片技術中的應用

王華  繆勇建

廣西醫科大學******附屬醫院病理科

骨髓穿刺組織石蠟包埋制片技術在病理技術工作中是重點，也是難點。組織固定、脫鈣、脫水是***基本***重要的一個步驟。多年以來，病理科一直使用乙醇二甲苯作為常規組織脫水劑、透明劑；二甲苯是一種具有強烈刺激性的揮發性液體，不僅污染環境，更危害人體健康；對環保與人體健康的關注，需要一種對人體無害安全并且能保持組織處理質量的環保替代品，作為病理技術工作中理想的脫水透明劑。本文就GS環保試劑對骨髓組織脫水透明常規HE染色制片、免疫組化檢測及原位雜交檢測效果進行評價。

 1. 材料和方法

  1.1 材料

選擇廣西醫科大學******附屬醫院病理科骨髓穿刺活檢標本15例。其中大致正常骨髓2例，增生性骨髓4例，骨髓瘤4例，骨髓發育異常綜合癥（MDS）4例，NK/T細胞淋巴瘤骨髓累及1例。

  1.2主要儀器

Shandon Pathcentre全自動脫水機，Shandon Finesse切片機，櫻花全自動HE染色機，美國ThermoBrite Abbott公司原位雜交儀。

  1.3試劑

GS環保固定脫水試劑（由哈爾濱格林標本技術開發有限公司研制并生產），免疫組化試劑（一抗北京中杉金橋生物技術有限公司，二抗上海長島生物技術有限公司），EBER原位雜交試劑盒（PanPath公司）。

 2. 方法

  2.1固定與脫鈣

40例骨髓穿刺標本均進行4%中性緩沖甲醛******次固定24小時，10%硝酸甲醛脫鈣液脫鈣30分鐘。

  2.2組織脫水

采用GS環保固定脫水試劑處理 ，步驟如下： = 1 \* GB3 ① GSA01（Ⅰ）2h，GSA01（Ⅱ）1h； = 2 \* GB3 ②70%乙醇40min，80%乙醇40min；  = 3 \* GB3 ③GSA02（Ⅰ）1h， GSA02（Ⅱ）40min； = 4 \* GB3 ④GSA03（Ⅰ）1h，GSA03（Ⅱ）40min；⑤GSA04（Ⅰ）1h，GSA04（Ⅱ）40min；⑥GSA05（Ⅰ）40min；GSA05（Ⅱ）50min；⑦GSA06（Ⅰ）1h，GSA06（Ⅱ）1h，石蠟包埋，切片，厚1.5微米。

  2.3 HE染色

日本櫻花公司全自動HE染色推薦程序染色。

  2.4免疫組化染色 

采用SupervisionTM鼠兔通用二步法進行免疫組化染色，增生性骨髓檢測CD3，CD20，CD43，CD61，CD68，MPO，KI-67；骨髓瘤檢測CD38，CD138，KI-67，CD20，CD79a；骨髓發育異常綜合癥檢測CD3，CD20，MPO，CD138，CD117，F8；NK/T細胞淋巴瘤骨髓累及檢測CD2，CD3，CD5，CD7，CD4，CD8,GrB,CD56；具體染色步驟同常規。

  2.5 ISH檢測

NK/T細胞淋巴瘤骨髓累及應用PanPath公司EBER原位雜交試劑盒,參照試劑盒說明書推薦的步驟操作。

 3. 結果

使用GS環保固定脫水試劑處理的20例標本，在切片中感覺組織塊軟硬適中，切片厚薄均勻，薄切時連續性好，切片平整。GS環保固定脫水試劑處理的骨髓組織中各系骨髓細胞常規HE染色效果好，細胞形態完整，著色好，細胞收縮不明顯，核漿對比清晰，粒系細胞胞漿中嗜酸、嗜堿、嗜中性顆粒清晰可見 （圖A、B、C）。各項免疫組化染色，細胞抗原性保存好，陽性結果定位準確，背景清晰（圖D、E、F、G）。一例NK/T細胞淋巴瘤骨髓累及進行EBER原位雜交檢測，陽性結果準確定位在腫瘤細胞核，陽性信號清晰，背景干凈（圖H ）。

 4.討論

骨髓病理是臨床病理診斷中的重要的一個部分，也是一個難點。造成骨髓組織診斷困難有幾個原因：(1)正常骨髓細胞成分復雜，各系細胞處于不同的發育階段形態特點多樣；(2)淋巴造血系統疾病復雜多變，骨髓穿刺的組織少，增加了病理診斷的難度；(3)骨髓組織必須經過脫鈣處理后才能進行脫水石蠟包埋制片，脫鈣處理對保持骨髓的組織細胞結構造成一定的影響。

傳統使用10%中******爾馬林作為固定液、乙醇二甲苯作為脫水透明劑，對組織滲透能力強，固定均勻，因此過去很長時間作為病理科常規固定脫水劑；但在實踐中發現，使用乙醇二甲苯作為脫水透明劑處理骨髓穿刺組織，骨髓組織硬化明顯，骨髓細胞收縮較大，導致切片厚薄不均，切片不平滑，難以切薄片等現象。骨髓病理石蠟制片的好壞不但與組織固定存在著密切的關系，也與組織的脫水透明有重要的關系。固定脫水透明的效果不但直接影響骨髓病理石蠟切片HE染色的質量，更有可能免疫組化與原位雜交檢測的結果。隨著分子病理學的不斷發展，基因檢測等新技術的應用也對固定組織的質量要求越來越高，因此，選擇一種安全有效的固定脫水透明試劑處理組織以達到******狀態，對骨髓病理診斷非常關鍵。

病理實驗室將二甲苯作為透明劑使用，它極易揮發，是一種對人體具有較強毒害作用的有機化學試劑。其毒性主要是刺激皮膚和眼睛。靶器官為胎兒、呼吸系統以及神經中樞系統。反復接觸，產生神經毒性效應（記憶力下降、協調不良、情緒波動和******性神經損傷）。普通的手套材料不能提供充分的保護^[1,2]。采用GS環保型試劑對骨髓穿刺組織進行固定脫水透明，對組織滲透力強，透明劑較溫和，處理組織軟硬適中，不易使組織變硬變脆，骨髓組織出現收縮和硬化現象明顯減輕，取得了理想的制片效果。

參考文獻

[1] John D, Bancroft, Marilyn Gamble ．組織學技術的理論與實踐[M]．周小鴿、劉勇主譯，北京:北京大學醫學出版社，2010，25-26.

[2] 高蓉梅，彭鳳翔，李永春．TO型生物制片透明劑取代二甲苯在病理制片中的應用[J].診斷病理學雜志，2009，12（2）:147.

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